論文開(kāi)題報(bào)告：米曲霉非同源重組蛋白ku70基因無(wú)痕敲除打靶載體的構(gòu)建

大學(xué)本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))開(kāi)題報(bào)告
學(xué)院：化工學(xué)院 　　　　　　　　　　　　　專(zhuān)業(yè)班級(jí)：08生物工程1班　　
課題名稱(chēng) 米曲霉非同源重組蛋白ku70基因無(wú)痕敲除打靶載體的構(gòu)建

1、本課題的的研究目的和意義：
構(gòu)建一種新型打靶載體，無(wú)痕敲除非同源組蛋白ku70基因，提高同源重組的概率，進(jìn)而提高后續(xù)基因敲除的打靶效率。敲除*dh、ladA等基因,從而構(gòu)建米曲霉代謝工程菌，可用于今后進(jìn)行同源重組，為敲除木糖醇脫氫酶基因打下基礎(chǔ)。


2、 文獻(xiàn)綜述（國(guó)內(nèi)外研究情況及其發(fā)展）：
無(wú)痕基因敲除指既能敲除掉靶基因，卻不引入標(biāo)記基因的基因敲除方法。使用“拉圖爾系統(tǒng)”敲除基因后不會(huì)留下任何外源片段，該系統(tǒng)可以在其他位點(diǎn)重復(fù)使用。只要有一個(gè)負(fù)選擇標(biāo)記基因，該系統(tǒng)就可以只依賴(lài)于同源重組而發(fā)揮作用，這個(gè)機(jī)理在生物體內(nèi)是高度保守的[1]。該方法不需要特別的酶或序列參與，基本原理和操作步驟均很簡(jiǎn)單，具有相當(dāng)高的效率，可廣泛被應(yīng)用等特點(diǎn)�！袄瓐D爾系統(tǒng)”可以同時(shí)有效敲除長(zhǎng)100kb，含有33個(gè)基因的一段染色體區(qū)域，且可以識(shí)別關(guān)鍵
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*dhA的載體pMD19－pyrG—*dhB，利用粘性末端連接法，將*dhA-A片段連接到pMD19－pyrG—*dhB，構(gòu)成pMD19－pyrG―*dhAB片段。
(2) 完成了*dhA-A片段連接后，通過(guò)平末端連接方法將*dhA-C片段連接到pMD19－pyrG—*dhAB上，完成新型的載體的構(gòu)建工作。
二、基因工程菌的篩選和驗(yàn)證。
4、擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題：
（1）如何提高同源重組和打靶效率，從而高效篩選出目的基因工程菌。
（2）米曲霉ladA基因敲除后，可能會(huì)再出現(xiàn)其別的拯救途徑，如可能有其它旁路途徑會(huì)出現(xiàn)�？煽紤]在此基礎(chǔ)上繼續(xù)敲除其它酶基因，阻斷旁路代謝。
5、研究思路、方法和步驟：
一、思路：
無(wú)痕基因敲除指既能敲除掉靶基因，卻不引入標(biāo)記基因的基因敲除方法。因此我們采用了一種新的染色體修飾方法——“拉圖爾系統(tǒng)”，使用“拉圖爾系統(tǒng)”敲除基因后不會(huì)留下任何外源片段，該系統(tǒng)可以在其他位點(diǎn)重復(fù)使用。只要有一個(gè)負(fù)選擇標(biāo)記基因，該系統(tǒng)就可以只依賴(lài)于同源重組而發(fā)揮作用，這個(gè)機(jī)理在生物體內(nèi)是高度保守的。
二、方法：
構(gòu)建這樣一個(gè)載體，它具有*dhA的上游結(jié)構(gòu)（*dhA-A，*dhA-B）和下游結(jié)構(gòu)（*dhA-C），也具有pyrG基因，導(dǎo)入米曲霉體內(nèi)后通過(guò)兩次同源重組敲除*dhA：第一次同源重組可以使這個(gè)載體整合到*dhA的上游，所得陽(yáng)性重組子是含有pyrG，我們可以用不含尿嘧啶核苷的培養(yǎng)基把它篩選出來(lái)。由于這樣的重組子在pyrG的上游具有*dhA下游結(jié)構(gòu)(*dhA-C)，使得DNA分子內(nèi)發(fā)生第二次同源重組成為可能，一旦分子內(nèi)第二次重組成功，則pyrG和*dhA將會(huì)一起被剔除掉，由于不含pyrG的菌株可以避免5-氟乳清酸這一代謝拮抗劑進(jìn)入代謝嘧啶堿的合成途徑，所以在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的培養(yǎng)基上，可以篩選出不含有pyrG的重組菌株[7]，同時(shí)也就是*dhA的剔除株。選用pMD19-T質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建這一載體。pMD19-T質(zhì)粒是pUC19質(zhì)粒的一種線(xiàn)性改造質(zhì)粒，在其3端具有多聚T尾，通過(guò)TA和酶切連接，我們可以依次連接上pryG、*dhA-B、*dhA-A和*dhA-C片段。
三、步驟：
首先以米曲霉KBN616基因組為模板，分別擴(kuò)增出ku70基因上游片段K-A、K-B，ku70基因下游片段K-C及標(biāo)記pyrG基因。而后分別以這四個(gè)片段為模板，設(shè)計(jì)多對(duì)引物，分別擴(kuò)增出片段1、片段2、片段3和片段4。其中片段1上帶有酶切位點(diǎn)EcoRI/HindIII，片段2上帶有酶切位點(diǎn)HindIII/KpnI，通過(guò)三段酶切連接，可將片段1和片段2連接到質(zhì)粒pUC57上，得到亞克隆載體pUC57-A。同理，通過(guò)片段3和片段4上的酶切位點(diǎn)KpnI /BamHI和BamHI/ SalI，可將片段3和片段4連接到質(zhì)粒pUC57上，得到亞克隆載體pUC57-B。而后分別提質(zhì)粒、PCR擴(kuò)增亞克隆載體pUC57-A和pUC57-B，可分別獲得片段A和片段B。利用片段A上的酶切位點(diǎn)EcoRI/KpnI和片段B上的酶切位點(diǎn)KpnI/ SalI，再次三段酶切連接，可將片段A和片段B連接到質(zhì)粒pUC57上，最終獲得打靶載體pUC57-pyrG-ku70ABC。該法充分利用了K-A片段及pyrG片段上已有的酶切位點(diǎn)，通過(guò)融合PCR的方式構(gòu)建中間片段，而后通過(guò)三段酶切連接的方式構(gòu)建亞克隆載體和打靶載體，避免了反復(fù)的轉(zhuǎn)化和繁瑣的平端連接步驟，快速高效的完成了打靶載體的構(gòu)建。
6、本課題的進(jìn)度安排：
2011.09-2011.10 查閱相關(guān)的文獻(xiàn)，制定具體的實(shí)驗(yàn)方案；
2011.10-2011.11 構(gòu)建新型打靶載體pMD19-pyrG-ladA-ABC；
2011.11-2011.12 米曲霉CaCl2/PEG原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化；基因工程菌的篩選和驗(yàn)證;
2011.12-2012.01 解決一些后續(xù)問(wèn)題 ……（未完，全文共4136字，當(dāng)前僅顯示2089字，請(qǐng)閱讀下面提示信息。收藏《論文開(kāi)題報(bào)告：米曲霉非同源重組蛋白ku70基因無(wú)痕敲除打靶載體的構(gòu)建》）