鳳凰木根部病害病原物的分離及鑒定（開題報告）

大學本科畢業(yè)論文(設計)開題報告
學院：化工學院　　　　　　　　專業(yè)班級：2009級生物技術(shù)（1）班

課題名稱 鳳凰木根部病害病原物的分離及鑒定

1、 本課題的研究目的和意義：
鳳凰木，豆科鳳凰木屬，野外屬瀕危物種，目前已由人工引種栽培，因鮮紅或橙色的花朵配合鮮綠色的羽狀復葉，被譽為世上最色彩鮮艷的樹木之一，故被廣泛栽種為觀賞樹，為廈門市市樹。但由于鳳凰木溫和的生長環(huán)境，易受根部病原菌侵染，侵染初期病癥不易察覺，患病樹木一般在感染后期才出現(xiàn)明顯病征，從而造成一定的損失。研究表明，鳳凰木根部的主要病原菌為褐根病病原菌（由真菌Phellinus no*ius引起），因此本課題通過對廈門市金尚路已患病而死的鳳凰木根部病原菌的分離與鑒定，診斷其是否因患褐根病而死，從而作出相應的政策用于實際問題。這對于防止褐根病病害在樹木間散播，以及趁早辨認該病害及作出相應的應急政策，具有一定的經(jīng)濟價值。


2、 文獻綜述（國內(nèi)外研究情況及其發(fā)展）：
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1）必須移除病情嚴重的樹木和除去土壤中感染病菌的殘根及子實體，然后燒毀，同時可考慮在病樹與健康樹間挖掘深溝，以阻隔病原。據(jù)報道指褐根病病菌可存在于泥土中的殘根長達10年或更久，土壤中可能藏有帶病殘根，所以應將患褐根病的樹木連泥土一并處理。
（2）對于病情輕微的樹木，可施用克力星等藥劑治療褐根病，藥劑的濃度須參考使用說明，每三個月灌注根部一次。
（3）在病區(qū)作業(yè)后，必須將工具如：刀、剪、鏟及運輸工具徹底消毒。



3、 本課題的主要研究內(nèi)容（提綱）和成果形式：
（1）感染組織的觀察及采樣：樹木患褐根病的樹冠會出現(xiàn)衰弱癥狀，但樹冠并沒有病原菌的存在，要確認樹木是否患褐根病，需觀察到樹木莖基部及根部的病征，以黃褐色的菌絲面及受感染木材組織的黃褐色網(wǎng)紋為主要依據(jù)。病組織的采樣，也需要采集黃褐色的菌絲面及周邊組織和具有黃褐色網(wǎng)紋的木材組織。
（2）采用選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)褐根病病原菌。
（3）提取鳳凰木根部病害病原菌的DNA，并進一步進行PCR反應及鑒定。
（4）分析實驗過程及實驗結(jié)果。
4、 擬解決的關(guān)鍵問題：
（1）分離培養(yǎng)基的制備及相應的無菌操作。
（2）患病鳳凰木根部及莖基部樣品的采集及病原菌的分離及鑒定操作。
（3）PCR反應條件的控制及熟練掌握引物設計的基本原則。
①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。
②引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
③引物內(nèi)部不應出現(xiàn)互補序列。
④兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3′端的互補重疊。
⑤引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。
（4）根據(jù)核酸分子大小，選擇合適的電泳介質(zhì)及電泳條件。


5、研究思路、方法和步驟：
（1）研究思路：本實驗通過三種不同的方法由表及里，從現(xiàn)象到本質(zhì)一步一步找出所研究的鳳凰木的病因。
（2）方法：病征法是最初級也是最簡單的方法；分離培養(yǎng)法涉及到培養(yǎng)基的制備，單一菌落的分離，無菌操作等技術(shù)；PCR分子診斷法涉及到核酸的提取、電泳、純化等分子生物學的實驗方法。
（3）實驗步驟：
1）病征法：褐根病的特有病征表現(xiàn)于莖基部與根部，受害林木莖基部及根部表面常有黃色、深褐色至黑褐色菌絲面，但在根部的菌絲面常與泥沙結(jié)合而不明顯。受害林木如出現(xiàn)上述病征就可確定為罹患褐根病。菌絲面在樹皮表面凹陷處較易形成，一般鮮少生長在高于離地1公尺以上的樹干。但常因林木死亡時間太長或環(huán)境氣候干燥或有些樹種黃褐色菌絲面不易觀察。如未觀察到典型菌絲面，可于莖基部及根部的樹皮剝開，受感染的樹皮內(nèi)面及木材組織呈不規(guī)則黃褐色網(wǎng)紋，此黃褐色網(wǎng)紋亦可視為褐根病的特有病征。如果仍未觀察到典型菌絲面與黃褐色網(wǎng)紋，可將感染的木材組織放置在封口塑料袋內(nèi)，保持高相對濕度2-5日，病組織表面可形成黃褐色菌絲面。有些患褐根病樹木的莖基部可觀察到黃褐色到黑褐色的平伏至具菌蓋的子實體，子實體比菌絲面堅硬且有細小菌孔。
（2）分離培養(yǎng)法：對于枯死已久的林木，利用病征法有時無從判斷是否為褐根病，則可用分離培養(yǎng)法來確定枯死樹木是否為褐根病。利用褐根病菌選擇性培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)感染腐朽的木材。將感染腐朽木材的表面泥土刷干凈，切成小塊。大小約0.5 * 0.5 * 0.5㎝3，每一感染腐朽木材切取10-20小塊，以每個培養(yǎng)皿放入4小塊，將接好小 ……（未完，全文共5473字，當前僅顯示1922字，請閱讀下面提示信息。收藏《鳳凰木根部病害病原物的分離及鑒定（開題報告）》）