論文開題報(bào)告：半夏遺傳結(jié)構(gòu)SSR標(biāo)記分析

大學(xué)本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))開題報(bào)告
學(xué)院：化工學(xué)院　　　　　　　　　專業(yè)班級(jí)：09級(jí)園藝（觀賞園藝）

課題名稱 半夏遺傳結(jié)構(gòu)SSR標(biāo)記分析

1、 本課題的的研究目的和意義：
半夏[Pinellia ternata (Thunb.) Breit.]是天南星科植物，藥用部分為其干燥塊莖，其味辛，性苦，有小毒，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)等功效。其入藥歷史悠久，備受歷代醫(yī)家推崇，是一味常用傳統(tǒng)中藥。盡管在我國半夏野生資源分布十分廣闊，但近年來，隨著其市場(chǎng)需求量的持續(xù)增加，野生資源不斷減少和半夏栽培技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后三者之間矛盾的日益加劇，我國半夏資源蘊(yùn)藏量和產(chǎn)量都大幅下降。如何加強(qiáng)半夏資源的保護(hù)和滿足市場(chǎng)需求，是當(dāng)今中藥工作者急需解決的問題。
本研究擬利用多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)的SSR標(biāo)記對(duì)半夏的主要分布區(qū)湖北省、四川省、安徽省、云南省、貴州省等16個(gè)省共45個(gè)半夏_進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)的研究分析，以期為半夏遺傳資源的保存及利用提供依據(jù)。

2、文獻(xiàn)綜述（國內(nèi)外研究歷史和現(xiàn)狀）：
目前針對(duì)半夏的植株形態(tài)變異、有效成分、馴化栽培、炮制技術(shù)及真?zhèn)伪鎰e等方面都有大量相關(guān)的研究報(bào)道，但是在對(duì)半夏遺傳資源保存與利用具有極大指導(dǎo)意義的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性分析等方面的研究鮮有報(bào)道。已有的
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的遺傳標(biāo)記�，F(xiàn)有的應(yīng)用SSR對(duì)植物進(jìn)行的研究如下：
孫琦等應(yīng)用SSR標(biāo)記進(jìn)行了玉米遺傳育種的研究；金夢(mèng)陽等構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜的SSR標(biāo)記遺傳圖譜，得到了65個(gè)SSR標(biāo)記；Tang等 利用SSR分子標(biāo)記對(duì)14個(gè)花生屬野生種和來自多個(gè)不同國家的24個(gè)花生栽培種進(jìn)行親緣關(guān)系研究，結(jié)果表明花生栽培品種可被劃分為兩個(gè)主要類群和4個(gè)亞類群。Zhan等對(duì)48個(gè)高粱、蘇丹草及其近緣種進(jìn)行SSR標(biāo)記研究，發(fā)現(xiàn)該48個(gè)樣品可被 聚為5個(gè)類群，且高粱和蘇丹草關(guān)系十分密切,可歸為同一品種。
經(jīng)過本人大量的資料查找發(fā)現(xiàn)目前尚未有人利用SSR標(biāo)記分析半夏的遺傳結(jié)構(gòu)，故本課題擬利用SSR標(biāo)記對(duì)16個(gè)省共45個(gè)居群的半夏樣品進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)的研究，以期對(duì)半夏資源的保護(hù)與利用提供參考依據(jù)。


3、本課題的主要研究?jī)?nèi)容（提綱）和成果形式：
3.1主要研究?jī)?nèi)容
半夏遺傳結(jié)構(gòu)的SSR標(biāo)記分析：篩選合適、足量的引物對(duì)對(duì)來源16個(gè)省的45份半夏樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析其遺傳結(jié)構(gòu)。
3.2成果形式
根據(jù)篩選的14對(duì)引物對(duì)142份半夏樣本的SSR-PCR電泳圖結(jié)合相應(yīng)的軟件得出PPL值、He值、Gst值、Nm值等，分析居群和物種水平遺傳多樣性、居群間遺傳分化程度及聚類分析。


4、擬解決的關(guān)鍵問題：
①SSR-PCR體系與程序的優(yōu)化；
②利用得到的數(shù)據(jù)兼顧表型性狀分析半夏遺傳結(jié)構(gòu)。


5、研究思路、方法和步驟：
5.1 DNA提取
采用改良的CTAB法提取45份142個(gè)樣本基因組DNA，利用瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA的完整性，微量紫外分光光度計(jì)測(cè)DNA濃度（10ng/μl），記錄相應(yīng)的A260/280 值、260/230 值及DNA濃度， 最后調(diào)節(jié)工作濃度到10ng/μl，-20℃保存。
5.2 引物篩選
參照相關(guān)文獻(xiàn)及半夏現(xiàn)有研究基礎(chǔ)，從48對(duì)引物中篩選出以下14對(duì)多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的引物用于多態(tài)性分析。
序號(hào) Code Tm Size 序號(hào) Code Tm Size
① EF513098(S/A) 48.6 206 ⑧ EF488247(JB-AG) 50.9 154
② EF488249(JB-AG) 49.4 134 ⑨ EF513106(S/A) 50.9 214
③ EF488256(JB-AG) 49.4 99 ⑩ AY451853(S/A) 51.8 153
④ EF488272(JB-AC) 49.5 128 ⑪ AY243112(S/A) 52.3 206
⑤ EF488248(JB-AG) 50.0 137 ⑫ EF513100(S/A) 52.3 355
⑥ EF513108(S/A) 50.2 208 ⑬ EF513104(S/A) -- --
⑦ EF488281(JB-AC) 50.7 68 ⑭ EF513105(S/A) -- --


5.3 程序優(yōu)化
94℃預(yù)變性4 min→94℃變性40 s→Tm退火40s→72℃延伸1 min→35 個(gè)循環(huán)→循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5 min→4℃保存
如上所述，設(shè)置固定的程序，并根據(jù)不同引物設(shè)定不同退火溫度與Grad級(jí)數(shù)，通過顯帶情況優(yōu)化Tm值、循環(huán)次數(shù)等條件。

5.4 PCR擴(kuò)增
反應(yīng)體系共20μl，內(nèi)含：10* PCR Buffer、0.25 mmol/L dNTPs（TakaraBiotec.）、1.5mmol/L MgCl2、0.2 5μmol/L 引物、1.0UTaqDNA聚合酶（Takara Biotec）、25 ng模板DNA。

5.5 電泳和銀染
制膠（聚丙烯酰胺），上樣（6*DNA Buffer，10*DNA Marker），電泳，銀染（染色液，顯影液，終止液），拍照（凝膠成像系統(tǒng)拍照）

5.6 數(shù)據(jù)分析
每個(gè)樣品的擴(kuò)增電泳譜帶按有（1）和無（0）記錄，構(gòu)成原始數(shù)據(jù)矩陣。用POPGENE1.32、NTSYS-pc2.1和E*ell2003等軟件統(tǒng)計(jì)分析，主要包括引物篩選機(jī)其多態(tài)性，遺傳多樣性分析和聚類分析等方面。


6、本課題的進(jìn)度安排：
2013.02-2013.03：查閱相關(guān)文獻(xiàn)
2013.03-2013.05：篩選引物、優(yōu)化程序、體系，完成實(shí)驗(yàn)
2013.05-2013.06：數(shù)據(jù)分析及撰寫論文
2013.06：答辯

7、參考文獻(xiàn)：
[1] 胡新生. _遺傳結(jié)構(gòu)的理解[J]. 林業(yè)科學(xué),2 ……（未完，全文共4873字，當(dāng)前僅顯示2461字，請(qǐng)閱讀下面提示信息。收藏《論文開題報(bào)告：半夏遺傳結(jié)構(gòu)SSR標(biāo)記分析》）