論文開題報告：半夏遺傳結構SSR標記分析

大學本科畢業(yè)論文(設計)開題報告
學院：化工學院　　　　　　　　　專業(yè)班級：09級園藝（觀賞園藝）

課題名稱 半夏遺傳結構SSR標記分析

1、 本課題的的研究目的和意義：
半夏[Pinellia ternata (Thunb.) Breit.]是天南星科植物，藥用部分為其干燥塊莖，其味辛，性苦，有小毒，具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結等功效。其入藥歷史悠久，備受歷代醫(yī)家推崇，是一味常用傳統(tǒng)中藥。盡管在我國半夏野生資源分布十分廣闊，但近年來，隨著其市場需求量的持續(xù)增加，野生資源不斷減少和半夏栽培技術遠遠滯后三者之間矛盾的日益加劇，我國半夏資源蘊藏量和產(chǎn)量都大幅下降。如何加強半夏資源的保護和滿足市場需求，是當今中藥工作者急需解決的問題。
本研究擬利用多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好、特異性強的SSR標記對半夏的主要分布區(qū)湖北省、四川省、安徽省、云南省、貴州省等16個省共45個半夏_進行遺傳結構的研究分析，以期為半夏遺傳資源的保存及利用提供依據(jù)。

2、文獻綜述（國內(nèi)外研究歷史和現(xiàn)狀）：
目前針對半夏的植株形態(tài)變異、有效成分、馴化栽培、炮制技術及真?zhèn)伪鎰e等方面都有大量相關的研究報道，但是在對半夏遺傳資源保存與利用具有極大指導意義的遺傳結構及遺傳多樣性分析等方面的研究鮮有報道。已有的
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的遺傳標記�，F(xiàn)有的應用SSR對植物進行的研究如下：
孫琦等應用SSR標記進行了玉米遺傳育種的研究；金夢陽等構建了甘藍型油菜的SSR標記遺傳圖譜，得到了65個SSR標記；Tang等 利用SSR分子標記對14個花生屬野生種和來自多個不同國家的24個花生栽培種進行親緣關系研究，結果表明花生栽培品種可被劃分為兩個主要類群和4個亞類群。Zhan等對48個高粱、蘇丹草及其近緣種進行SSR標記研究，發(fā)現(xiàn)該48個樣品可被 聚為5個類群，且高粱和蘇丹草關系十分密切,可歸為同一品種。
經(jīng)過本人大量的資料查找發(fā)現(xiàn)目前尚未有人利用SSR標記分析半夏的遺傳結構，故本課題擬利用SSR標記對16個省共45個居群的半夏樣品進行遺傳結構的研究，以期對半夏資源的保護與利用提供參考依據(jù)。


3、本課題的主要研究內(nèi)容（提綱）和成果形式：
3.1主要研究內(nèi)容
半夏遺傳結構的SSR標記分析：篩選合適、足量的引物對對來源16個省的45份半夏樣本進行PCR擴增并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析其遺傳結構。
3.2成果形式
根據(jù)篩選的14對引物對142份半夏樣本的SSR-PCR電泳圖結合相應的軟件得出PPL值、He值、Gst值、Nm值等，分析居群和物種水平遺傳多樣性、居群間遺傳分化程度及聚類分析。


4、擬解決的關鍵問題：
①SSR-PCR體系與程序的優(yōu)化；
②利用得到的數(shù)據(jù)兼顧表型性狀分析半夏遺傳結構。


5、研究思路、方法和步驟：
5.1 DNA提取
采用改良的CTAB法提取45份142個樣本基因組DNA，利用瓊脂糖電泳檢測DNA的完整性，微量紫外分光光度計測DNA濃度（10ng/μl），記錄相應的A260/280 值、260/230 值及DNA濃度， 最后調節(jié)工作濃度到10ng/μl，-20℃保存。
5.2 引物篩選
參照相關文獻及半夏現(xiàn)有研究基礎，從48對引物中篩選出以下14對多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的引物用于多態(tài)性分析。
序號 Code Tm Size 序號 Code Tm Size
① EF513098(S/A) 48.6 206 ⑧ EF488247(JB-AG) 50.9 154
② EF488249(JB-AG) 49.4 134 ⑨ EF513106(S/A) 50.9 214
③ EF488256(JB-AG) 49.4 99 ⑩ AY451853(S/A) 51.8 153
④ EF488272(JB-AC) 49.5 128 ⑪ AY243112(S/A) 52.3 206
⑤ EF488248(JB-AG) 50.0 137 ⑫ EF513100(S/A) 52.3 355
⑥ EF513108(S/A) 50.2 208 ⑬ EF513104(S/A) -- --
⑦ EF488281(JB-AC) 50.7 68 ⑭ EF513105(S/A) -- --


5.3 程序優(yōu)化
94℃預變性4 min→94℃變性40 s→Tm退火40s→72℃延伸1 min→35 個循環(huán)→循環(huán)結束后72℃延伸5 min→4℃保存
如上所述，設置固定的程序，并根據(jù)不同引物設定不同退火溫度與Grad級數(shù)，通過顯帶情況優(yōu)化Tm值、循環(huán)次數(shù)等條件。

5.4 PCR擴增
反應體系共20μl，內(nèi)含：10* PCR Buffer、0.25 mmol/L dNTPs（TakaraBiotec.）、1.5mmol/L MgCl2、0.2 5μmol/L 引物、1.0UTaqDNA聚合酶（Takara Biotec）、25 ng模板DNA。

5.5 電泳和銀染
制膠（聚丙烯酰胺），上樣（6*DNA Buffer，10*DNA Marker），電泳，銀染（染色液，顯影液，終止液），拍照（凝膠成像系統(tǒng)拍照）

5.6 數(shù)據(jù)分析
每個樣品的擴增電泳譜帶按有（1）和無（0）記錄，構成原始數(shù)據(jù)矩陣。用POPGENE1.32、NTSYS-pc2.1和E*ell2003等軟件統(tǒng)計分析，主要包括引物篩選機其多態(tài)性，遺傳多樣性分析和聚類分析等方面。


6、本課題的進度安排：
2013.02-2013.03：查閱相關文獻
2013.03-2013.05：篩選引物、優(yōu)化程序、體系，完成實驗
2013.05-2013.06：數(shù)據(jù)分析及撰寫論文
2013.06：答辯

7、參考文獻：
[1] 胡新生. _遺傳結構的理解[J]. 林業(yè)科學,2 ……（未完，全文共4873字，當前僅顯示2461字，請閱讀下面提示信息。收藏《論文開題報告：半夏遺傳結構SSR標記分析》）