論文開題：固定化木聚糖酶用于生物反應器的研究

大學本科畢業(yè)論文(設計)開題報告

課題名稱 固定化木聚糖酶用于生物反應器的研究

1、 本課題的的研究目的和意義：
木聚糖酶(*ylanase)是降解木聚糖酶系中最關鍵的酶，在飼料、食品、紡織、造紙等行業(yè)應用廣泛，是重要的工業(yè)用酶之一。但該酶穩(wěn)定性差、保質期短、重復利用率低、應用成本高，因此木聚糖酶的廣泛應用受到了一定的限制[1]。類彈性蛋白(Elastin-like polypeptides，ELPs)具有對溫度及鹽濃度等敏感相變的性質，通過可逆熱循環(huán)(Inverse thermal cycling，ITC)方法純化蛋白可以達到有高效的，成本低廉的特點。通過基因融合的方法合成木聚糖酶-類彈性蛋白的重組蛋白，利用類彈性蛋白的可逆相變性質將重組蛋白純化出來，得到固定化木聚糖酶。將固定化木聚糖酶用于生物反應器，使定向固定與木聚糖酶的催化反應同時進行，這種方法比較溫和，節(jié)省了純化步驟的開支，同時更有利于應用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。研究固定化木聚糖酶用于生物反應器的動力學參數(shù)，進一步優(yōu)化反應條件，可以為酶膜反應器以及工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎。
2、 文獻綜述（國內外研究情況及其發(fā)展）：
定向固定主要是通過不同的方法,將酶的特定位點與載體連接, 使酶在載體表面按一定的方向排列, 使它的活性位點面朝固體表面的外
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其中有大部分的重組蛋白沒有回復可溶的狀態(tài)，只有很少一部分的變?yōu)榭扇軤顟B(tài)，原因可能是重組蛋白在發(fā)生想變時與雜蛋白一起聚集成顆粒，很多雜蛋白與酶鑲嵌在一起甚至包裹著酶從而使得酶無法回復能可溶的狀態(tài)，但是ELP連接的重組蛋白可以作為分子定向固定，而且這種定向固定化是通過共價鍵連接，連接的非常穩(wěn)定。因此研究這種分子標簽作為載體的定向固定有很大的意義。
生物反應器，是指利用酶或生物體（如微生物、動植物）所具有的特殊功能，在體外進行生物化學反應的裝置系統(tǒng)。本實驗是研究固定化木聚糖酶催化木聚糖酶水解的反應，故使用的反應器又可稱為酶反應器。酶反應器可以分為[12]：分批式反應器、連續(xù)流反應器以及中空纖維反應器等。其中，分批反應器為最簡單的酶反應器，只需要加入固定化酶，使其懸浮于攪拌罐中，這種反應的速度決定于攪拌速度。而本實驗是將固定化木聚糖酶與木聚糖置于適宜條件下的恒溫水浴磁力攪拌器中，讓其可以在適宜的攪拌速度下均勻穩(wěn)定的進行酶促反應，屬于間歇式酶反應器[13]。通過測定反應過程中不同時間內的木聚糖水解度，構建數(shù)學模型，從而進一步分析該反應的動力學參數(shù)[14]，最終確定該酶促反應所具有的最適反應條件，例如：底物最適濃度、反應器有效體積等。

3、 本課題的主要研究內容（提綱）和成果形式：
類彈性蛋白具有對鹽濃度和溫度敏感的相變性質可以用來純化與其相連接的蛋白質。本實驗首先對含有類彈性蛋白-木聚糖酶重組蛋白的大腸桿菌進行擴大培養(yǎng)，通過離心得到菌體之后，進行細胞破碎。將木聚糖酶置于高于相變溫度的環(huán)境中，之后再置于相變溫度之下的環(huán)境中，大部分呈現(xiàn)聚集狀態(tài)的固定化酶不能很好的恢復到松散的狀態(tài)，因而研究相變溫度之上的聚集態(tài)固定化酶的性質。利用ITC可逆相變循環(huán)的方法純化出一小部分重組蛋白，大部分的酶定向固定在ELP標簽上，將固定化木聚糖酶用于生物反應器中，使其與木聚糖進行酶促水解反應，通過設定反應器中的適于酶促反應的條件，使酶促反應可以在溫和持續(xù)不變的反應條件下反應完全，通過實驗考察得到固定化木聚糖酶的動力學參數(shù)，重復利用次數(shù)、最適反應時間以及反應器的有效體積等，并優(yōu)化生物反應器中酶促反應的最佳條件。
4、擬解決的關鍵問題：
（1）、提高固定化木聚糖酶的回收率。
（2）、固定化木聚糖酶用于生物反應器時最佳反應條件的確定。
5、研究思路、方法和步驟：
（1）、將含有類彈性蛋白-木聚糖酶的重組蛋白的大腸桿菌擴大培養(yǎng)；
（2）、將收集到的大腸桿菌進行超聲波破碎；
（3）、對破碎的菌體進行ITC可逆相變循環(huán)，收集固定化木聚糖酶；
（4）、固定化木聚糖酶用于生物反應器中的反應條件的優(yōu)化；
（5）、測定固定化酶可以重復利用的次數(shù)；
（6）、測定并分析固定化酶用于生物反應器中的動力學參數(shù)。
6、本課題的進度安排：
2013年3月1日至2013年3月20日，有關文獻的查找。
2013年3月21日至2013年4月5日，固定化木聚糖酶的提取、純化以及酶活的測定。
2013年4月10日至2013年5月， 構建固定化木聚糖酶反應器，測定相關參數(shù):固定化木聚糖酶重復利用次數(shù)、反應初速度、反應常數(shù)等。
2013年5月至6月， 寫論文，準備畢業(yè)答辯。
7、參考文獻：
1. 張麗萍, 陳晨, 殷婷婷, 等. 固定化木聚糖酶的應用研究進展[J]. 化學世界, 2010, 636(1)(11):697-700.
2. Wilchek M, Miron T. Oriented versus random protein immobilization. J Biochem Biophys Methods 2003,55:67-70.
3. Gaj T, Meyer SC, Ghosh I. The AviD-tag, a NeutrAvidin/avidin specific peptide affinity tag for the immobilization and purification of recombinant proteins. Protein e*pression and purification 2007,56:54-61.
4. Kuan I, Liao R, Hsieh H, Chen K, Yu C. Properties of Rhodotorula gracilis d-Amino Acid O*idase Immobilized on Magnetic Beads through His-Tag. Journal of bioscience and bi ……（未完，全文共4966字，當前僅顯示2508字，請閱讀下面提示信息。收藏《論文開題：固定化木聚糖酶用于生物反應器的研究》）