論文開題：北極產(chǎn)蛋白酶菌株VV8、VV9及VV52的分類鑒定

大學(xué)本科畢業(yè)論文(設(shè)計(jì))開題報(bào)告
學(xué)院：化工學(xué)院　　　　　　　　　　　　　專業(yè)班級：　　生物技術(shù)專業(yè)

課題名稱 北極產(chǎn)蛋白酶菌株VV8、VV9及VV52的分類鑒定

1、本課題的的研究目的和意義：

(1)本研究對菌株VV8和VV9進(jìn)行分類鑒定，闡明細(xì)菌與其他類群之間的親緣關(guān)系。
(2)對極地微生物的測定作初步探索，并為極地微生物產(chǎn)低溫蛋白酶的低溫適應(yīng)性研究和其實(shí)際應(yīng)用打下一定的基礎(chǔ) 。

2、文獻(xiàn)綜述（國內(nèi)外研究情況及其發(fā)展）：


20世紀(jì)70年代以前，生物類群間的親緣關(guān)系主要是根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化、行為習(xí)性等表型特征以及少量的化石資料來判斷它們之間的親緣關(guān)系。這些方法至今仍作為微生物的判斷依據(jù)之一。
自從1675年，荷蘭商人Leeuwenhock自制了第一架顯微鏡，并首先觀察到被他稱為“微小動物”的第一個(gè)微生物以來。隨著其他
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（蛋白質(zhì)、RNA、DNA等）在進(jìn)化過程中的作用及其變化規(guī)律有了進(jìn)一步認(rèn)識，因此研究微生物的系統(tǒng)發(fā)育主要是分析和比較生物大分子的分子序列作為判斷各類生物進(jìn)化譜系的主要指征。60-70年代，有些科學(xué)家通過比對某些蛋白質(zhì)分子（如細(xì)胞色素C）的氨基酸順序進(jìn)行生物譜系分析。1981年，美國學(xué)者Carl Woese發(fā)現(xiàn)了測量所有微生物進(jìn)化關(guān)系的尺子：rRNA作為進(jìn)化的指征并建立16SrRNA系統(tǒng)發(fā)育樹。為了簡化測定過程，前后的幾十年間先后出現(xiàn)了另外一些方法，例如，測定核酸的堿基組成[(G+C)%]及分子雜交，血清學(xué)試驗(yàn)，噬菌體分型
，氨基酸順序，蛋白質(zhì)分析，細(xì)胞壁等細(xì)胞成分。


近20多年來，隨著微電子、計(jì)算機(jī)、分子生物學(xué)、物理及化學(xué)等先進(jìn)技術(shù)向微生物領(lǐng)域的_和多學(xué)科的交差，微生物的快速鑒定和自動化分析技術(shù)取得了突破性進(jìn)展。例如三大鑒定系統(tǒng)： API 細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)，Enterotube 系統(tǒng)，Biolog 全自動或手動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)；生物芯片的自動化運(yùn)用；生物信息學(xué)的建立及其檢索數(shù)據(jù)庫的運(yùn)用（NCBI、EMBL、DDBJ）。

2、 本課題的主要研究內(nèi)容（提綱）和成果形式：

主要內(nèi)容：本課題主要對分離自北極的蛋白酶產(chǎn)生菌株VV8、VV9以及VV52進(jìn)行分類鑒定，探索其系統(tǒng)進(jìn)化地位。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括16S rRNA 基因全長克隆測序及序列分析、生理生化特征實(shí)驗(yàn)、DNA中G+C mol%測定等。


成果形式：以數(shù)學(xué)模型和論文的形式提交成果。
4、擬解決的關(guān)鍵問題：

擬解決的關(guān)鍵問題：對優(yōu)化過程中若干參數(shù)的相互影響與干擾進(jìn)行細(xì)致調(diào)節(jié)，努力獲得全局化考量。

5、研究思路、方法和步驟：

5.1 16S rRNA 基因全長克隆測序及序列分析
（1）菌種平板劃線接種
通過平板劃線法進(jìn)行菌種活化及獲取單一菌落，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)菌:分離自北極的蛋白酶生產(chǎn)菌株VV8、VV9及VV52；受體菌：大腸桿菌TOP10F菌種。培養(yǎng)后4℃保存?zhèn)溆谩?br>（2）細(xì)菌總DNA的提取
先分別取VV8、VV9、VV52以及TOP10F單一菌落接種于適量LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌株活化，再使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。取少量基因組進(jìn)行電泳定性檢測，其余置于-20℃ 保存，備用。
（3）瓊脂糖凝膠電泳
（4）16S rRNA基因PCP擴(kuò)增
（5）PCR 產(chǎn)物純化
（6）連接反應(yīng)
（7）感受態(tài)細(xì)胞的制備
（8）感受態(tài)細(xì)胞效價(jià)
（9）pMD18-T Vector轉(zhuǎn)化
（10）菌落PCR
（11）16SrRNA基因全長測序
（12）16S rRNA基因核酸內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
（13）聚丙烯酰胺凝膠電泳
（14）16S rRNA基因序列分析
5.2 高效液相色譜法測定基因組DNA 中G＋C mol％含量
1） DNA 定量
2） DNA 的水解
3） 色譜分離條件
5.3細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)






6、本課題的進(jìn)度安排：
1）第1周：查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，熟悉實(shí)驗(yàn)室的基本操作流程和規(guī)范，了解菌株鑒定的方法。根據(jù)所查相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。
2）第2-6周：16S rRNA 基因全長克隆測序及序列分析 ……（未完，全文共2776字，當(dāng)前僅顯示1764字，請閱讀下面提示信息。收藏《論文開題：北極產(chǎn)蛋白酶菌株VV8、VV9及VV52的分類鑒定》）