論文開題報告書：桉樹轉(zhuǎn)基因檢測方法的研究

目錄/提綱：……
4、擬解決的關(guān)鍵問題：（1）、優(yōu)化出最優(yōu)的桉樹芽直分培養(yǎng)基
1、4不同Cef濃度對桉樹外植體再生能力的影響
1、第一、二周熟練掌握試驗所需儀器的使用，并查找文獻(xiàn)，設(shè)定試驗方案
2、第三~五周對芽直分培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化
3、第六~八周對生根培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化
4、第九~十一周對暗培養(yǎng)時間、侵染時間進(jìn)行優(yōu)化
5、十二~十四周對導(dǎo)入基因進(jìn)行檢測，找出最優(yōu)方法
6、五月底開始寫畢業(yè)論文，六月初交論文初稿
7、論文經(jīng)審核后進(jìn)一步修改，進(jìn)行預(yù)答辯和答辯
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大學(xué)本科畢業(yè)論文(設(shè)計)開題報告
學(xué)院：化工學(xué)院 　　　　　　　　　　　　　專業(yè)班級：08生物工程一班　

課題名稱 桉樹轉(zhuǎn)基因檢測方法的研究


1、 本課題的的研究目的和意義：
目的：通過正交試驗，找出桉樹愈傷組織分化產(chǎn)生芽的最優(yōu)培養(yǎng)基；篩選出最適合農(nóng)桿菌侵染桉樹愈傷組織的條件（如侵染時間、暗培養(yǎng)時間、頭孢濃度等）；通過對多種目的基因檢測方法的試驗，確定目的基因是否成功導(dǎo)入，并確定最準(zhǔn)確、方便、快捷的檢測方法。

意義：通過一系列的試驗，確定最優(yōu)直分培養(yǎng)基，提高發(fā)芽率，以便進(jìn)行重復(fù)性試驗或大規(guī)模培養(yǎng)；同時，出芽率的提高有利于目的基因的成功導(dǎo)入，為抗寒、高木質(zhì)素基因的導(dǎo)入提供更好的條件，增加 成功率；轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的優(yōu)化可以更加準(zhǔn)確的確定目的基因是否成功導(dǎo)入受體細(xì)胞，增加試驗的準(zhǔn)確性。
綜述: 桉樹在我國的應(yīng)用廣泛，在生
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系統(tǒng)一直未能較好建立。本試驗桉樹葉和莖為對象, 建立了百合基因轉(zhuǎn)化直接分化受體系統(tǒng), 為基因轉(zhuǎn)化獲得抗逆性強(qiáng)的桉樹奠定了基礎(chǔ)。
3、 本課題的主要研究內(nèi)容（提綱）和成果形式：
1. 轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)化
2. 轉(zhuǎn)基因桉樹的檢測
3. 用酚-氯仿法提取DNA、PCR檢測
4、 擬解決的關(guān)鍵問題：
（1）、優(yōu)化出最優(yōu)的桉樹芽直分培養(yǎng)基。
（2）、選擇優(yōu)化出最準(zhǔn)確、快捷的轉(zhuǎn)基因桉樹苗檢測技術(shù)。
（3）、確定最優(yōu)的基因?qū)霔l件。

5、 研究思路、方法和步驟
一．轉(zhuǎn)基因體系的優(yōu)化
1.1直分培養(yǎng)基優(yōu)化方案一：KT、NAA、蔗糖濃度、及瓊脂添加量對桉樹的莖和葉的直接分化影響（根據(jù)因素水平選擇四因素三水平正交表，實驗重復(fù)兩次）
1.2 直分培養(yǎng)基優(yōu)化方案二：6-BA、IAA、Cys添加量對桉樹的莖和葉的直接分化影響（根據(jù)因素水平選擇5因素4水平正交表）
1.3不同Kem濃度對桉樹外植體再生能力的影響。
1.4不同Cef濃度對桉樹外植體再生能力的影響。
1.5侵染法和超聲法對導(dǎo)入桉樹組織目的基因成功率的影
二． 轉(zhuǎn)基因桉樹的檢
2.1轉(zhuǎn)基因植物PCR檢測
.提取DNA方法（CTBA法）：
1）．稱取1g新鮮桉樹葉片片，置于預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，將葉片研至粉末。
2）．將葉片粉末轉(zhuǎn)入一個30mL離心管中。
3）.加10mL CTBA抽提緩沖液，輕輕轉(zhuǎn)動離心管使之混勻。于65℃溫育10min。加入等體積的氯仿－異戊醇，輕輕顛倒混勻。
4）．室溫下4000r/min離心10min，回收上層水相。在回收的上層水相中。
5）.加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇(預(yù)冷至－20℃)，輕輕混勻，置冰箱中放置數(shù)小時甚至過夜，使核酸沉淀下來。
6）．室溫下4000r/min離心10min。
7）．小心倒去上清液，用80％乙醇洗滌沉淀物。盡量瀝干乙醇，置于真空干燥器內(nèi)干燥，，稱重，計算產(chǎn)率。
8）．將DNA沉淀溶于1mL TE中。
.PCR檢測方法：
⑴ PCR 反應(yīng)體系
10*buffer 2.5ul
2mM dNTPs 2ul
Prime 1 1ul
Prime 2 1ul
模板 1ul
Taq酶 0.5ul
ddH2O 補至25ul
⑵ PCR 運行程序
94℃預(yù)變性 10min
94℃變性 45sec
54℃退火 45sec 35 個循環(huán)
72℃延伸 2min
72℃延伸 10min
⑶ 瓊脂糖凝膠電泳
2.2卡那霉素抗性篩選
將導(dǎo)入目的基因的桉樹幼苗或者愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有km的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過觀察其成活率確定目的基因是否成功轉(zhuǎn)入。
6、本課題的進(jìn)度安排：

1. 第一、二周熟練掌握試驗所需儀器的使用，并查找文獻(xiàn)，設(shè)定試驗方案。
2. 第三~五周對芽直分培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。
3. 第六~八周對生根培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。
4. 第九~十一周對暗培養(yǎng)時間、侵染時間進(jìn)行優(yōu)化。
5. 十二~十四周對導(dǎo)入基因進(jìn)行檢測，找出最優(yōu)方法。
6. 五月底開始寫畢業(yè)論文， ……（未完，全文共2694字，當(dāng)前僅顯示1712字，請閱讀下面提示信息。收藏《論文開題報告書：桉樹轉(zhuǎn)基因檢測方法的研究》）