畢業(yè)設計開題：米曲霉磷酸果糖激酶基因的克隆及生物信息學分析

大學本科畢業(yè)論文(設計)開題報告
學院：化工學院　　　　　　　　　　　　　專業(yè)班級：08生物工程1班

課題名稱 米曲霉磷酸果糖激酶基因的克隆及生物信息學分析

1、本課題的的研究目的和意義：
研究目的：
1.本課題通過PCR擴增得到磷酸果糖激酶基因，構建重組質粒并轉化到大腸桿菌中以得到磷酸果糖激酶的陽性克隆，為后續(xù)構建表達載體，蛋白活性表達奠定基礎。
2.對米曲霉磷酸果糖激酶進行酶學分析，二級、三級結構預測，為米曲霉的糖酵解代謝調控奠定基礎。為闡述米曲霉的中心碳代謝流提供依據(jù)。

研究意義：
糖酵解途徑（EMP）是糖代謝的重要生理途徑，其主要作用是在有氧條件下為生物體迅速提供能量，其中磷酸果糖激酶是糖酵解途徑的關鍵限速酶。米曲霉磷酸果糖激酶基因的克隆及酶學分析能更闡述米曲霉糖酵解途徑，為米曲霉的相關代謝調控奠定基礎。
2、 文獻綜述（國內外研究情況及其發(fā)展）：
米曲霉（Aspergillus oryzae ） 是一種好氣性真菌，屬于半知菌亞門、曲霉屬，菌絲一般呈黃綠色
……（新文秘網(wǎng)http://www.120pk.cn省略721字，正式會員可完整閱讀）……　
C5.7.1.11）是糖酵解EMP途徑中的限速酶，負責催化6-磷酸果糖為1，6-二磷酸果糖：ATP + 6-磷酸果糖 → ADP + 1，6-二磷酸果糖，其N 末端為結合ATP 的結構單元，C 末端為結合6-磷酸果糖的結構單元和磷酸烯醇式丙酮酸反饋調節(jié)時結合的部分[12]。目前磷酸果糖激酶的研究主要集中在原核生物中，如韓蓓等進行了球形芽胞桿菌C3-41磷酸果糖激酶的克隆、表達及基本生物活性[11]，周傳奇等進行了騰沖嗜熱厭氧菌6-磷酸果糖激酶的克隆[12],表達及其生物活性，周雍進進行了利迪鏈霉菌初級代謝關鍵基因的克隆與功能分析[13]，但是絲狀真菌報道較少。米曲霉磷酸果糖激酶基因克隆和酶學分析不僅能為后期進行蛋白酶的表達創(chuàng)造條件，更清楚地闡述米曲霉糖酵解途徑，為米曲霉的相關代謝調控奠定基礎。
3、 本課題的主要研究內容（提綱）和成果形式：
主要的研究內容：
本課題通過PCR擴增得到磷酸果糖激酶基因的克隆，構建pMD19-T重組質粒并轉化到大腸桿菌中,利用藍白斑篩選得到磷酸果糖激酶的陽性轉化子，利用菌液PCR、凝膠電泳和酶切驗證克隆產(chǎn)物，并對克隆的基因進行基因測序，最后通過生物信息學手段對該基因編碼的酶進行酶學分析、高級結構預測和進化分析。

成果形式：
本課題致力于米曲霉磷酸果糖激酶的克隆，主要的成果展示為電泳圖譜展示，其中包含了一些實驗測的的數(shù)據(jù)以及和國內研究情況的對比分析，并通過生物信息學對該基因編碼的酶的高級結構進行預測和酶學分析，企圖從糖酵解途徑中關鍵酶出發(fā)，為闡述米曲霉糖酵解途徑和代謝調控奠定基礎。最終的成果主要以實驗數(shù)據(jù)、電泳圖譜和生物信息學分析預測來組合展示，已提供直接的學習、研究材料，以備今后做進一步的探究。

4、擬解決的關鍵問題：
不同基因具有各自的特異性，需要摸索磷酸果糖激酶的克隆條件，獲得PCR產(chǎn)物，并進行有效的連接和轉化。

目前課題研究存在的主要困難
由于米曲霉磷酸果糖激酶基因片段較長（2469bp），體外擴增較困難，需要對其體外擴增條件進行探究；另外長片段在連接和轉化時也會遇到一定的困難。在挑選陽性克隆子時實驗量較大。
5、研究思路、方法和步驟：

研究思路和步驟：
1、通過NCBI和DOGAN等數(shù)據(jù)庫獲得米曲霉果糖激酶基因序列，設計引物并合成，
2、提取米曲霉全基因組利用設計的引物進行PCR，提純產(chǎn)物，
3、構建重組質粒并轉化大腸桿菌，
4、篩選陽性克隆并驗證產(chǎn)物。
5、對克隆后的基因序列進行生物信息學分析

主要涉及的研究方法：
1、本課題中，經(jīng)過對相關的文獻閱讀和一定的實驗比較，建立了米曲霉已糖激酶克隆的實際操作體系；
2、本課題中利用primer5.0設計PCR引物，利用PCR產(chǎn)物提取和凝膠提取兩種方法提純產(chǎn)物；
3、本課題中利用藍白斑法篩選陽性克隆子，利用菌液PCR和凝膠電泳驗證產(chǎn)物；
4、利用生物信息學相關軟件對該基因及酶進行分析。

6、本課題的進度安排：

2012.2.15-2012.3.1： 查找文獻，查找基因序列并設計引物
2012.3.2-2012.3.15： 探索PCR條件，構建重組質粒，轉化大腸桿菌；
2012.3.16-2012.4.15：篩選陽性克隆子并驗證，及生物信息學分析；
2012.4.16-2012.4.30：對研究結果進行驗證性復合實驗，以保證實驗的結論準確性；
2012.5.1-2012.5.20： 寫論文，準備答辯；

7、參考文獻：
[1] 趙龍飛,徐亞軍.米曲霉的應用研究進展[J].中國釀造,2006,(3)
[2] 王海娟,蘇玉春,吳銘等.米曲霉木聚糖酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達[J].生物技術通訊,2010, ……（未完，全文共4006字，當前僅顯示2023字，請閱讀下面提示信息。收藏《畢業(yè)設計開題：米曲霉磷酸果糖激酶基因的克隆及生物信息學分析》）