畢業(yè)論文：新型產(chǎn)柚苷酶菌株P(guān)hyllobacterium sp.Wb51b的篩選及其鑒定

題目：新型產(chǎn)柚苷酶菌株P(guān)hyllobacterium sp.Wb51b的篩選及其鑒定

院（系） 化 工 學(xué) 院 ＿
專 業(yè) 生 物 技 術(shù)

新型產(chǎn)柚苷酶菌株P(guān)hyllobacterium sp.Wb51b的
篩選及其鑒定
摘要
柑橘類水果果汁的深加工過程中會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的苦味，使用柚苷酶進(jìn)行酶法脫苦可以收到良好的效果。此外柚苷酶在其他食品、醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域內(nèi)有著廣泛的應(yīng)用，其經(jīng)濟(jì)效益越來越得到重視。柚苷酶來源十分廣泛，但目前國(guó)內(nèi)外的研究主要集中于真菌和酵母菌上，對(duì)產(chǎn)柚苷酶細(xì)菌的研究較少。本研究通過對(duì)土壤中細(xì)菌的富集培養(yǎng)篩選出一株柚苷酶高產(chǎn)菌Wb51b。從形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和16S rDNA等方面對(duì)菌株Wb51b進(jìn)行鑒定，分析結(jié)果表明菌株Wb51b為葉桿菌屬(Phyllobacterium)。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果表明該菌株為革蘭氏陰性，其生理生化特征經(jīng)由對(duì)照鑒定手冊(cè)，表明其與模式菌株有區(qū)別。最后，對(duì)該菌株的生長(zhǎng)情況和柚苷酶的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果表明其酶的表達(dá)情況與菌株的生長(zhǎng)情況基本一致，同時(shí)在時(shí)間為64h左右時(shí)達(dá)到最大值，分別為58.7U/mL和OD600為0.63。
關(guān)鍵詞: 柚苷酶；脫苦；細(xì)菌鑒定



Screening and identification of Phyllobacterium sp.Wb51b, a new naringinase producer
Abstract
Citrus fruit juices will give serious bitterness durin
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目錄
摘要 I
Abstract II
目錄 III
1緒論 1
1.1柚苷酶 1
1.2柚皮苷 1
1.3柚苷酶高產(chǎn)菌株的篩選 2
1.3.1產(chǎn)柚苷酶細(xì)菌的篩選 2
1.3.2產(chǎn)柚苷酶真菌的篩選 2
1.4柚苷酶的應(yīng)用 3
1.4.1柚汁加工 3
1.4.2其他應(yīng)用 3
1.5本論文研究的目的、意義及內(nèi)容 4
2材料與方法 5
2.1實(shí)驗(yàn)材料 5
2.1.1樣品來源 5
2.1.2主要試劑 5
2.1.3主要儀器和設(shè)備 5
2.1.4培養(yǎng)基及溶液 6
2.2實(shí)驗(yàn)方法 7
2.2.1采樣 7
2.2.2富集培養(yǎng) 7
2.2.3初篩 7
2.2.4復(fù)篩 7
2.2.5菌種保藏 8
2.3菌種的鑒定 8
2.3.1培養(yǎng)特征 8
2.3.2形態(tài)特征 8
2.3.3系統(tǒng)發(fā)育特征 8
2.4生理生化特征 11
2.5檢測(cè)與分析方法 11
3結(jié)果與討論 14
3.1菌種的篩選 14
3.2選取目的菌株 14
3.3形態(tài)學(xué)特征 15
3.3.1 菌落形態(tài) 15
3.3.2革蘭氏染色 16
3.3.2生理生化特征 16
4 結(jié)論與展望 21
參考文獻(xiàn) 22





1 緒論
1.1 柚苷酶
柚苷酶廣泛存在于各種絲狀真菌，在其他各種微生物體、多種動(dòng)植物體組織中也有發(fā)現(xiàn)。Hall在1938年首次發(fā)現(xiàn)芹菜種子中的柚苷酶[1]。因其水解活性可使柑橘類果汁脫苦，柚苷酶有著廣闊的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用前景。
柚苷酶（Naringinase）是一種復(fù)合水解酶，包含ɑ-L-鼠李糖苷酶（ɑ-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）和 β-D-葡萄糖苷酶（flavonoid-β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21）這兩種酶的活性。它可以將柚皮苷（Naringin）水解成鼠李糖和普魯寧，并進(jìn)一步水解得到葡萄糖和柚皮素（Naringenin）。其水解過程如圖1所示。












1.2 柚皮苷
柚皮苷的分子式是C22H32O14，分子量580.53，化學(xué)名稱是4,5,7-三羥基黃烷酮-7-鼠李糖葡萄糖苷，主要存在于柚子及柑橘類水果的果皮和種子中，果肉中含量相對(duì)較少。它溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸、稀堿溶液和熱水，常溫下在水中的溶解度為0.1%，75℃時(shí)可達(dá)10%，不溶于石油醚、乙醚、苯和氯仿等非極性溶液[3]。
據(jù)報(bào)道，柚皮苷具有抗癌、抑菌、抑酶、抗氧化、降血膽固醇、降低毛細(xì)血管脆性、改善微循環(huán)、治療非典型性肺炎等生理活性，在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用價(jià)值[4]。
1.3 柚苷酶高產(chǎn)菌株的篩選
1.3.1 產(chǎn)柚苷酶細(xì)菌的篩選
產(chǎn)柚苷酶的細(xì)菌報(bào)道比較少見，主要是因?yàn)檫@些產(chǎn)柚苷酶的細(xì)菌在工業(yè)上具有很多好處，導(dǎo)致很多學(xué)者對(duì)細(xì)菌產(chǎn)柚苷酶的研究秘密進(jìn)行 [5]。盡管這樣，最近還是有學(xué)者對(duì)細(xì)菌產(chǎn)柚苷酶進(jìn)行了文獻(xiàn)報(bào)道。Gaston Orillo[6]等從南極海水中分離獲得Pseudoalteromonas和Ralstonia pickettii，在-1-8℃的低溫條件下具有ɑ-L-鼠李糖苷酶活性。Hashimoto[7]等發(fā)現(xiàn)以蘭膠為碳源的S. paucimobilis和Bacillus sp. GL1具有很高的ɑ-L-鼠李糖苷酶活性。Beekwilder[8]和Avila[9]等在乳桿菌屬中發(fā)現(xiàn)具有ɑ-L-鼠李糖苷酶活性。Puri和Kaur[10]等分離獲得一株具有α-L-鼠李糖苷酶活性的Staphylococcus *ylosus。該菌株經(jīng)優(yōu)化后，柚苷酶的產(chǎn)量到達(dá)8.45U/mL[11]。用5L發(fā)酵罐優(yōu)化后，在糖濃度15g/L時(shí)其產(chǎn)量達(dá)到8.91U/mL[12]。
1.3.2 產(chǎn)柚苷酶真菌的篩選
產(chǎn)柚苷酶的真菌研究是一個(gè)相對(duì)成熟的方面，目前商業(yè)化的柚苷酶也是來自于真菌，如來自于美國(guó)的Sigma公司就有商品柚苷酶，該商品酶產(chǎn)自青霉。
Puri和Kalra[13]利用黑曲霉MTCC1344獲得胞外柚苷酶，其中糖蜜和蛋白胨是最佳的碳源和氮源，培養(yǎng)基中加入金屬離子可以提高酶的產(chǎn)率。Busto等[14]從黑曲霉CECT2088中誘導(dǎo)獲得柚苷酶。同年，Birgisson等[15]從E.coli中獲得ɑ-L-鼠李糖苷酶并設(shè)計(jì)出一個(gè)反應(yīng)器用于柚皮苷的水解。為了獲得新的柚苷酶來源，Thammawat等[16]于2008年在中國(guó)臺(tái)灣分離獲得348株真菌，研究表明柚苷酶的最適溫度和最適pH值分別為40℃和4.0。其中黑曲霉BCC25166被用于進(jìn)一步的研究，結(jié)果顯示在對(duì)發(fā)酵過程優(yōu)化獲得酶活最高的條件是3.75g/L鼠李糖為碳源和2.5g/L硝酸鈉為氮源。Chang等[17]分離獲得醬油曲霉具有很高的柚苷酶活性,研究表明該醬油曲霉產(chǎn)的柚苷酶能夠?qū)κ称贩矫娴拿摽嘤泻芎玫男Ч?br>李利君等[18]獲得一株產(chǎn)柚苷酶的酵母菌--羅倫隱球酵母Jmedeb008，其中該酵母的柚苷酶產(chǎn)酶受到葡萄糖效應(yīng)的影響。
1.4 柚苷酶的應(yīng)用
1.4.1 柚汁加工
柚子為雙子葉植物綱無患子目蕓香科柑橘屬植物，喬木。果實(shí)呈圓球形、扁圓形、梨形或闊圓錐形，橫徑通常10厘米以上，淡黃或黃綠色。柚子含有豐富的蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、維生素以及鈣、磷、鎂、鈉等人體必需的元素，每100g可食用部分含水88.4g、蛋白質(zhì)0.7g、脂肪0.6g、糖10.2g、鈣41mg、磷43mg、鐵0.9mg[19]。柚子對(duì)高血糖、高血壓、高血脂、糖尿病、血管硬化等疾病有較好的輔助治療作用。
我國(guó)有著豐富的柑橘資源，但柑橘加工過程的瓶頸在于產(chǎn)生的苦味難以消除，其苦味物質(zhì)是檸檬苦素和柚皮苷，而柚皮苷是主要苦味物質(zhì)。工業(yè)上一般采用中性多聚吸附劑或微酸吸附樹脂進(jìn)行吸附脫苦，但成本較高且會(huì)破壞果汁原有的營(yíng)養(yǎng)成分。采用柚苷酶水解柚皮苷不僅可使苦味降低90%以上，而且作用專一，不會(huì)對(duì)果汁風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分有任何影響[20]。汪釗 ……（未完，全文共17854字，當(dāng)前僅顯示3211字，請(qǐng)閱讀下面提示信息。收藏《畢業(yè)論文：新型產(chǎn)柚苷酶菌株P(guān)hyllobacterium sp.Wb51b的篩選及其鑒定》）