論文：生防菌哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵培養(yǎng)基的響應面優(yōu)化

論文：生防菌哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵培養(yǎng)基的響應面優(yōu)化
曾慶才1,2,肖榮鳳2,劉波2*,胡桂萍2

福州大學生物科學與工程學院,福建 福州 350108;2.

福建省農業(yè)科學院農業(yè)生物資源研究所,福建 福州 350003)

摘要:

利用響應面方法研究生防菌哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵的培養(yǎng)基,探索疏松值、無機碳源、無機氮源對產孢量的影響.單因子實驗結果表明:哈茨木霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基的主成份、疏松值、最適無機碳源、最適無機氮源分別為微生物養(yǎng)豬墊料:麩皮=9:1、麥粒40%、蔗糖3%、硫酸銨2%.響應面分析結果表明:麥粒、蔗糖、硫酸銨對哈茨木霉產孢量有顯著相關性,通過求解回歸方程可得:當麥粒含量36.72%,蔗糖含量3.08%,硫酸銨含量1.74%時,孢子產量可達2.80*1010個/g.

關鍵詞:哈茨木霉 固體發(fā)酵 培養(yǎng)基 產孢量 響應面分析法

中圖分類號 Optimization of solid-state fermentation culture medium for the biocontrol strain of Trichoderma harzianum FJAT-9040 by response surface methodology. Abstract: Response surface methodology was used to optimize solid-state fermentation culture medium of Trichoderma harzianum FJAT-9
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劉愛榮等,2010;管懷驥等,2011;姚 彬等,2009);對黃瓜、花生和茄子等多種作物促進生長的作用(楊春林等,2008;王獻慧等,2012;胡 潔等,2012);誘導水稻等抗病性(Nzojiyobiri jean Berchmans等,2003)等等. 木霉菌要有良好的防治效果,生產發(fā)酵是關鍵.目前,生產上木霉的應用多有孢子菌劑,雖然不少學者對其代謝產物在生防作用上進行了研究(李 杰等,2011;王紅梅等,2010;郭培磊等,2009),但是由于代謝產物的復雜性,增加樣品處理的難度,使實驗操作工作量大,大大增加了生產成本,最終未能很好地在工業(yè)上應用.通過發(fā)酵方式(液體發(fā)酵或固體發(fā)酵)可以獲得更多的孢子量.由于液體發(fā)酵所需設備相對復雜,發(fā)酵產物濃度不高,生產成本高(葛 龍等,2010),而固體發(fā)酵具有培養(yǎng)基來源豐富,價格低廉,操作簡單,孢子質量好等一系列優(yōu)勢被公認為是獲得真菌孢子的最好方法之一(敖新宇等,2012).固體發(fā)酵的培養(yǎng)基可以是稻草、麩皮、秸桿等農業(yè)副產物,近年來興起地微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術帶來了新的農業(yè)副產物——微生物養(yǎng)豬墊料.它是通過微生物將谷殼,鋸末等發(fā)酵床原料及豬的糞尿的混合物中的有機物質進行分解發(fā)酵,使墊料中含有豐富的養(yǎng)料(藍江林等,2012).若將其作為固體發(fā)酵的培養(yǎng)基,能為菌株提供豐富的營養(yǎng)物質,不但可以獲得大量的生防因子,還可以處理一些農業(yè)副產物,提高資源的利用價值,實現可持續(xù)發(fā)展.目前,仍較少見以微生物養(yǎng)豬墊料作為微生物固體發(fā)酵主要基質的報道. 微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法很多,如單因素實驗法、正交設計試驗法、響應面優(yōu)化設計法等(肖懷秋等,2010),其中響應面優(yōu)化設計以試驗次數少,周期短等優(yōu)勢受到廣泛應用(郝學財等,2006).響應面分析法是通過合理的實驗設計,獲得一定數據來擬合一個響應面,從而摸擬出真實的極限條件下的曲面,并進行可靠性地分析(張秀霞等,2012).響應面分析法可以對一次項、二次項及其交互項對響應值的影響進行分析,通過之間的關系在響應面上獲得最佳點,在試驗設計與試驗分析上具有更多優(yōu)勢(張秀霞等,2012). 本研究以微生物養(yǎng)豬墊料作為哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵的主要培養(yǎng)基,通過單因素實驗與響應面法進行哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化,篩選出哈茨木霉FJAT-9040最適產孢的固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方,旨在進一步提高哈茨木霉FJAT-9040的產孢量和農業(yè)副產物的利用率,為含哈茨木霉的生物菌肥和制劑的工業(yè)化生產提供理論指導.

1 材料與方法

1.1 供試菌種 哈茨木霉FJAT-9040,本研究所微生物菌種保存中心保存.

1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g,蒸餾水 1 L,pH 自然. 固體發(fā)酵培養(yǎng)基 微生物發(fā)酵一年墊料、麩皮、麥粒、碳源、氮源、自來水等按適合比例混合

1.3 方法

1.3..1 固體發(fā)酵培養(yǎng)基主要成份墊料與麩皮配比的篩選 主要成份墊料與麩皮按體積比為10:0,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,0:10等配制7種培養(yǎng)基,每處理重復3次.組培瓶中裝50 ml培養(yǎng)基,初始含水量40%,封口膜封口,121 ℃,滅菌30 min,冷卻后,接入哈茨木霉FJAT-9040孢子懸浮液(1.0*107個/ ml),初設接種量為5%,28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d.待發(fā)酵結束后,取5 g固體發(fā)酵物于45 ml無菌水中,用磁力攪拌器攪拌均勻,并將其稀釋至適當倍數后,吸取100 ul,于PDA平板上涂布均勻,28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d,記錄平板上的孢子數.孢子數/g=同一稀釋度平均孢子數*10*稀釋倍數/5.篩選出最佳的主要成份配方.

1.3..2 培養(yǎng)基中麥粒含量對哈茨木霉FJAT-9040產孢量的影響 往1.3.1中篩選出的培養(yǎng)基中添加浸泡過夜的麥粒,按體積比為10%、20%、30%、40%、50%進行添加,每處理重復3次.以下處理方法同1.3.1.篩選出最佳的疏松值含量.

1.3..3培養(yǎng)基中碳源對哈茨木霉FJAT-9040產孢量的影響 往1.3.1中篩選出的培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖、蔗糖、乳糖,每處理重復3次.以下處理方法同1.3.1.篩選出最佳的無機碳源及最適濃度.

1.3..4培養(yǎng)基中氮源對哈茨木霉FJAT-9040產孢量的影響 往1.3.1中篩選出的培養(yǎng)基中添加硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉,每處理重復3次.以下處理方法同1.3.1.篩選出最佳的無機氮源及最適濃度.

1.3..5響應面優(yōu)化設計 在單因素篩選實驗的基礎上,根據Bo*-Benhnken設計原理,采用軟件Design e*pert8.0進行三因素三水平的響應面的分析實驗,以孢子數為響應量,確定各因素對哈茨木霉FJAT-9040產孢量影響的顯著性和各組分的最佳組合.根據Bo*-Benhnken設計原理,響應因子Y為哈茨木霉FJAT-9040的產孢量,麥粒(*1)、蔗糖(*2)和硫酸銨(*3)為三因素,因素三水平分為:-1、0和1、試驗設計具體見表1. 表1培養(yǎng)基Bo*-Behnken因素水平表 Table1 The table of Bo*-Behnken factors 變量 代碼 編碼水平 未編碼 編碼 -1 0 1 麥粒 *1 A 30% 40% 50% 蔗糖 *2 B 1.0 g 1.5 g 2.0 g 硫酸銨 *3 C 0.5 g 1.0 g 1.5g 1.4 數據處理 數據統(tǒng)計分析通過E*CEL數據處理,響應面分析法利用Design-e*pert 8.0軟件采用Bo*-Benhnken設計方法,對培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件進行三因素三水平優(yōu)化. 2 結果與分析 2.1 固 ……（未完，全文共12960字，當前僅顯示3083字，請閱讀下面提示信息。收藏《論文：生防菌哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵培養(yǎng)基的響應面優(yōu)化》）